丹皮酚对原代培养的大鼠皮质和海马神经元缺糖缺氧再灌损伤的保护作用 _中医药学书籍_电子版书.pdf

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1、丹皮酚对原代培养的大鼠皮质和海马神经元缺糖缺氧再灌损伤的保护 作用 宋宁 宁 魏欣冰 刘 春 武继 彪 张袖美 1 山 东 大 学 医 学 院 药 理 学 研 究 所 济 南 2 5 0 0 1 2 2 山 东 省 中 医 药 高 等 专 科 学 校 山 东莱PH 2 6 0 0 6 2 摘要 目 的 研究丹皮酚对大鼠 神经元缺糖缺氧再灌损伤的保护作用 并 探讨其作用机制 方法建立原代培养的新生大鼠 神经 元 缺 糖缺 氧 再灌 损伤 模型 随 机 分 组为 对照 组 模型 组 丹 皮酚 组 建立 模型 每个 再灌时间 点 均经 2 X 1 0 6 1 x 1 0 6 5 x 1 0 6 m

2、o l L 3 个 浓度药 物处理 M K 8 0 1 阳 性对照药 组 倒置 相差 显微镜下 进行一 般形态 学 现 察 用M T T 法测定 神经元 存活率 通过放射配基结合实验浏定N 甲基一 天门冬氛酸受体 N M D A受体 结合力 采用荧光法测定细胞内游离钙离子 C a z 1 i 浓度及应用 试刘盒侧定一氧化氮 N O 含量及一氧化氮 合酶 N O S 活性 结果 丹皮酚可显著降 低大鼠皮质和海 马 神经元缺糖缺氧再灌损伤时细胞死亡率 减弱N M D A受体结合力 降 低神经细胞内 游离 钙离 子浓度 C a t i 及N O含量 N O S 活 性的升高 结论丹皮酚对离 体培养的

3、大鼠 神经元缺糖缺氧再灌损伤具有明显保护作用 其作用机制可能与抗氧化 及减弱N M D A受体结合力有关 关键词 丹皮酚 缺糖缺氧损伤 N M D A受体 氧自由 基 缺血性脑血管病 中图分类号 8 9 6 5文献标识码 A文章编号 1 0 0 1 2 4 9 4 2 0 0 7 0 5 0 3 5 3 0 5 P r o r e c t i v e E f f e c t s o f P a e o n o l o n C u l t u r e d C o r t i c a l a n d H i p p o c a m p a l N e u r o n s S u b j e c t

4、 e d t o O x y g e n G l u c o s e D e p r i v a t i o n a n d R e p e r f u s i o n i n R a t s S O N G N i n g n i n g t W E I X i n b in g L I U R u i W U J i b i a o 2 MA N G X iu m e i 1 I n s tit u te of P h a r m a c o lo g y S c h o o l of M e d ic i n e S h a n d o n g U n i v e r s 沂 J i n

5、 a n 2 5 0 0 1 2 C h i n a 2 S h a n d o n g T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c a l S c h o o l L a i y a n g 2 6 0 0 6 2 C h i n a A B S T R A C T O B J E C T I V E T o d e t e r m i n e i f p a e o n o l c a n p ro t e c t c u l t u r e d r a t n e u r o n s f r o m a n o x i a i n d u

6、c e d i n j u ry a n d e l u c i d a t e t h e u n d e r l y i n g m e c h a n i s m ME T H O D S T h e r a t n e u ro n s c u l t i v a t e d a s t h e o b j e c t o f s t u d y a n d t h e n b u i l d t h e m o d e l o f o x y g e n g l u c o s e d e p r iv a t io n a n d r e p e r f u s io n T h

7、e y w e r e r a n d o m ly d i v id e d i n to 4 g r o u p s c o n t r o l g r o u p i n j u r y m o d e l g ro u p p a e o n o l tr e a t m e n t g r o u p s t h e p a e o n o l w a s a d d e d b e f o r e r e p e r f u s i o n w h i c h i n c l u d e d t h e t h r e e c o n c e n t r a t io n o f

8、p a e o n o l 0 2 x 1 0 6 m o l L 一 P a e L 1 x 1 0 一 m o l L 一 P a e M a n d 5 x 1 0 6 m o l L 一 P a e H M K 8 0 1 g ro u p 1 0 x 1 0 6 m o l L 一 E a c h g r o u p w a s o b s e r v e d b y i n v e rt e d p h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p e n e u ro n v i a b il it y w a s m e a s u r e d

9、 b y t h e r e d u c ti o n o f 3 4 5 d i m e t h y lt h ia z o l 2 y l 一 5 d i p h e n y lt e t r a z o l i u m b r o m id e M T T b i n d i n g f o r c e o f N M D A re c e p to r s w a s e v a l u a t e d b y li q u i d s c i n ti ll a t io n c o u n t in g i n t r a c e ll u l a r C a l e v e l

10、w a s d e t e r m in e d b y fl u o r o s p e c t r o p h o t o m e t e r N O c o n t e n t a n d N O S a c t i v i ty w e r e o b s e r v e d R E S U L T S C o m p a r e d w i t h O G D r e p e r f u s i o n g ro u p a t e a c h d e s i g n a t e d p e r i o d p a e o n o l t r e a t m e n t a f t

11、e r O G D o b v i o u s l y i n c re a s e d c e ll s u r v i v a l r a t e a n d re d u c e d t h e b i n d i n g f o r c e o f N M D A r e c e p t o r s d e c r e a s e d t h e a c t iv i ty o f N O S a n d t h e c o n t e n t o f N O a n d i n t r a c e ll u la r C a 2 C O N C L U S I O N P a e o

12、 n o l c a n p r o te c t r e t n e u r o n s f r o m i s c h e m i a re p e r f u s i o n i n j u ry师 a l l e v i a t i n g m o r p h o l o g i c a l d a m a g e a n d i n c re a s i n g n e u r o n v i a b i l i t y K E Y WO R D S p a e o n o l o x y g e n g l u c o s e d e p r i v a t i o n N M D

13、 A r e c e p t o r o x y g e n f r e e r a d i c a l i s c h e m i c c e r e b r a l v a s c u l a r d i s e a s e 丹皮酚 p a e o n o l P a e 又称牡丹酚 是毛蓑科植 物牡丹 P a e o n ia s u ff m t ic o s a A n d r 根皮和萝摩科植 物徐长卿 只 y e a n o s te l m a p a n ic u l a t u m B u n g e K S c h u m 干 燥 根 或 全 草 的 主要 有 效 成分 一

14、 文 献报 道 丹皮酚具有脑保护作用 本研究拟用原代培养 的大鼠神经元缺糖缺氧再灌损伤模型 观察丹皮酚 对大鼠 神经元的保护作用 并探讨其作用机制 1 材料 丹皮酚注射液 上海第一生化药业有限公司 批号为Z 3 1 0 2 0 3 9 9 7 2 h 内新生Wi s t a r 大鼠 山东 大学实验动物中心 2 实验方法 基金项目 作者简介 国家自 然科学基金资助项目 3 0 5 7 2 1 8 7 宋宁宁 女 硕士研究生 通讯作者 张灿美 男 教授 博士生导师T e l 0 5 3 1 8 8 3 8 3 1 4 6 中国药学杂志2 0 0 7 年3 月第4 2 卷第5 期 石 石 瓦而万画

15、而丽而币衰丽瓦厉 3 5 3 2 1 新生 大鼠 神经细 胞原代培养 3 4 7 2 h内新生W i s t a r 大鼠 体积分数7 5 乙醇浸 泡消毒 无菌条件下剪开头皮及露骨分离出两侧脑 组织 主要是皮层及海马组织 在解剖显微镜下剥离 脑膜 用手术刀切成糜状 移人含0 1 2 5 胰蛋白酶 的磷酸缓冲液中于3 7 水浴消化2 0 一 2 5 m i n 终 止消化后弃去消化液 加人含 巧 胎牛血清的 D M E M培养液 美国S i g m a 公司 用小口 径吸管反 复吹打分散 2 0 0目 细胞筛过滤后 接种于预先涂有 0 1 0 多聚赖氨酸的3 5 m m塑料培养皿中 每皿 2 m

16、 L 置于3 7 9 C 5 C 0 2 培养箱中 孵育 于培养第3 天在培养液中加人细胞分裂抑制剂阿糖胞昔储备液 每皿3 w L 以抑 制非神经元细胞的 过度增殖 作用 4 8 h 后更换新鲜培养液 以后每周换液2 次 培养 8 一 1 2 d 开始实验 2 2 原代神经元缺糖缺氧 o x y g e n g l u c o s e d e p r i v a t io n O G D 再灌注损伤模型制备 5 6 神经元以2 4 孔培养板培养 制备模型前以平衡 盐缓冲液冲洗数次 使葡萄糖终浓度小于1 m m o l L 一 每 孔 加人1 0 0 W L 无糖H a n k 液 并放入缺 氧

17、盒内 持续缓慢通人含有9 5 N 2 5 C O 的混合 气体2 5 h 取出并吸弃平衡盐缓冲液 换以完全培 养基孵育 置人C O 培养箱 分别孵育6 1 2 2 4 h 2 3 神经元存活率的测 定 7 1 神经 细胞以 每 孔5 x 1 0 5 个于 孔培养板中 培养 至第8 天 随机分组为 对照组 模型组 缺糖缺氧再 灌注6 1 2 2 4 h 3 个时间 点 丹皮酚组 建立模型 每 个 再灌时间 点 均经低 0 2 x 1 0 6 m o l L 一 P a e L 中 1 x 1 0 6 m o 1 L 一 P a e M 高 5 x 1 0 6 m o l L P a e H 3

18、个浓度药物处理 M K 8 0 1 阳性对照药 组 M K 8 0 1 是N M D A 受体选择性拮抗剂 可对谷氨酸 产生非竞争性拮抗作用与N M D A受体相结合 不仅 可阻断兴奋J性氨基酸毒性作用 还通过抗氧化作用发 挥脑保护作用 该组处理同丹皮酚组 浓度为1 0 x 1 0 6 m o l L 一 达再灌时间 后加人终质量浓度为0 5 9 L 的M I T S i g m a 公司 置细 胞培养 箱中 继续培 养4 h 后弃培养液 加人每孔2 0 0匹 二甲基亚讽 D M S O 天津化学试剂一厂 将培养板平行振荡1 0 m i n 后 在酶联免疫检测仪 上海雷勃分析仪器有限 公司 上

19、测 定光吸收 值 测定波长为4 9 0 nn A w 以只加D M S O的孔为空白 对照 2 4 放射 配基结 合实 验测N M D A受 体结合 力 B 9 1 按原 代培养神经元的方法 将细胞以每孔1 0 6 个于培养瓶中培养 于培养第8 天 制备各实验组 3 5 4 瓦 茄瓦石石万而M a r c h 一 V a l 4 2 N o 5 O G D再灌损伤模型 吸弃培养液刮下细胞 细胞按 质量比 为1 1 0 的比例加入5 0 m m o l L 冰T ri s H A c 缓冲液 于4 低温离心 1 0 0 0 x g 1 0 m i n 取上清液 再次低温高速离心 1 2 0 0

20、0 x g 2 0 m i n 所得上清液即为 膜制剂 膜蛋白的 含量按L o w ry法 测定 用5 0 m m o l L T A E 稀释突触膜 调整蛋白 浓 度为1 一 3 g L 测 定管中 加人1 0 0 汕含膜 制 备的稀释液 在非特异性结合管中加人4 t m o l L 非标记的M K 8 0 1 液1 0 0 w L 和1 0 0 w L 缓冲 液 每测定管均加人3 0 C i m m o l 一 的 3 H M K 8 0 1 美 国S ig m a 公司 1 0 n m o l L 一 常温孵育1 h 反应结 束后加人预冷的5 0 m m o l L T r is H A

21、 c 缓冲液5 0 p L 在纤维素滤膜上抽滤 将纤维素滤膜置于闪 烁 杯中 7 5 烘箱烤干后加人7 m L甲苯闪烁液 以液 体闪 烁计数仪 测 定 H放射 性活 度 根 据实 验所得的 总结合 T B 和非特异性结合 N S B 求出特异结合 R L 的平均值 R L T B一 N S B 再根据 E和 S A 求出受体的结合位点数 R T 二 R UE x S A 1 0 2 5 神经元内 C 扩 i 的 动 态变 化 培养8d 的神经元制备各实验组 O G D再灌损 伤 模型 然后配 制成细 胞悬液 川 将细 胞悬液以 终 浓 度为5 p m o l L 一 的F u r a 2 A

22、M荧光染 料进行负 载后 置于荧光双波长分光光度计 日立F 3 0 0 0 型 进 行 测 定 1z 13 0 取1 x 1 0 6 个细胞负载F u r a 2 A M的细胞悬液 以激发光波长3 0 0 一 4 5 0 n m 发射光波长5 0 0 n m进 行扫描 检查荧光峰值达最高时的激发波长 判断细 胞负载情况 以峰值在3 4 0 n m左右处为最佳负载状 态 将测定方式转换为改变波长的时间扫描 波长 变换间隔为2 s 按以上参数执行双波长测定 测 定最大荧光比 值 R 和最小荧光比 值 R 加 破膜剂T r it o n X 1 0 0 终浓度为0 1 使F u r a 一和 C 扩

23、 十 结合达饱和 时 测得的 4 0 F 3 8 0 为R 加人 高浓度的C a t 鳌合剂E G T A 终浓度为5 m m o l L p H 8 5 以 充分 鳌合C 扩 十 使F u r a 一游 离 测 得 的 4 0 F 3 8 0为 R u o o F u r a 2 A M 检测 的 c a t 计算公式为 C a 2 二 K a R一 R l R 二一 R F F 2 一氧化氮 N O 含量和一氧化氮合酶 N O S 活 性测定 培养8d 的神经元制备各实验组O G D再灌损 伤模型收集其培养液 采用硝酸还原酶法测定 N O 的最终产物N 0 2 N O N O S 测定采用

24、分光光度 中国药学杂志2 0 0 7 年3 月第4 2 卷第5 期 法 14 o N O 和N O S 测 试 盒 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 2 7 统计学处理 实验数据以i t 表示 采用S P S S 统计软件进 行分析 采用双因素及三因素方差分析 P 0 0 5 作 为差异显著性界值 3 结果 3 1 丹皮酚对大乳鼠神经元缺糖缺氧再灌损伤的 保护作用 大鼠神经元培养8d 后 形态学观察可见细胞 呈锥形或多极性 胞体饱满清晰 边界清楚有明显的 光晕 有很强的折光性及立体感 神经元突起相互交 织成网状 细胞核明显可见 细胞经缺糖缺氧处理 后 折光性下降 胞体变圆 部分胞体肿

25、胀甚至消失 突起收缩断裂 胞浆内颗粒变性明显 丹皮酚发挥 对损伤神经元的保护作用 使缺糖缺氧神经元形态 损伤减轻 胞体完整 突起较清楚 应用M IT 法测 定神经元存活率 丹皮酚及 M K 8 0 1 可明显降低神 经元损伤时的细胞死亡率 P 0 0 1 见表t o 表1 丹皮酚对海马神经元缺糖缺氧再灌损伤的保护作 用 n 8 z t s T a b 1 E ff e c t s o f p a e o n o l o n t h e v i a b i l i t y o f O G D r e p e r f u s i o n i n j u r ed n e u r o n n 二 8

26、 z i s 表2 Ta b 2 丹皮酚 对 ca 2 i 升高的 抑 制 作用 n 8 士 E ff e c t s o f p a e o n o l o n t h e i n t r a c e ll u l a r c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n o f O G D r e p e r f u s io n i n j u r e d n e u r o n n 8 z 土 1 C a 2 1 G ro up L 一 一 6 h 12 h 一 2 4 h C o n tr o l 1 7 6 伪 1 0 0 1 04 1 7 6 0 6

27、 1 0 0 1 04 1 7 6 0 6 1 0 0 1 0 4 O G D R 5 8 5 9 8 1 巧 田 7 6 9 7 4 1 2 5 0 4 9 6 6 3 8 1 3 6 0 6 P a e L 0 2 x 1 0 一 2 1 9 8 1 土 1 3 5 5 2 3 5 9 9 0 士 2 3 3 2 2 3 9 9 1 0 上 3 3 1 7 2 P a e M 1 X 1 0 一 2 1 3刃土 1 6 1 9 2 3 5 4 绍土 2 4 8 1 2 3 4 3 龙士 游 护 P a e H 5 X 1 0 一 1 9 1 1 8 1 1 2 3 1 2 2 8 1 1

28、1 4 7 5 2 2 9 9 0 6 L 2 4 2 7 2 M K 801 1 0 x 1 0 6 2 0 3 8 5 土 1 1 5 8 2 3 2 1 4 8 士 0 0 1 3 2 3 5 0 3 3 士 2 4 妙 注 与 对 照 组 相比 P 0 0 1 与缺 搪缺 氧 再 灌损 伤 组 相比 2 P 0 0 1 N o te I p 0 0 1 c o n tr o l 2 P 0 0 1 V O G D R 起作用 因此 兴奋毒性的核心是兴奋性氨基酸受体 的激活 此外 N M D A R受体又是一配体门控型的 C a t 通道 N M D A R 受体结合力代表了N M D

29、A R 受体 的活力 缺糖缺氧损伤提高 N M D A R受体的活性 降 低N M D A R 受体活力既可阻断 兴奋 性氨基酸毒性 作用又抑制钙超载从而多方面发挥脑保护作用 丹 皮酚及阳性对照药 M K 8 0 1 可显著降低受体结合 力 即抑制了 受体的 活性 P 0 0 1 见表3 表3 丹皮酚对N M D A R结合力的作用 n 8 浮士 T a b 3 E ff e c t s o f P a e o n o l o n t h e a c t i v i t y o f N M D A r e c e p t o r o f O G D r e p e r f u s i o n

30、i n j u r e d n e u r o n n 二 8 x 士 s C 皿甲 C o n 加 I O GD R P a e L P a e M 1 a e H MK 8 0 1 c s i n 曲唱f o r c e 过N M D A r e ce p t o r n d L An n L一 t V i a b i l i ty m o l L 一 1 6h 1 2h 2 4h 1 0 0 1 5 0 1 1 0 0 1 5 0 1 1 0 0 1 5 0 1 6 4 2 8 t 2 2 3 6 1 3 8 L 2 3 3 1 6 0 8 3 1 4 1 2 1 0 2 x 1 0 6

31、 7 5 9 1 士 3 5 4 2 7 0 3 8 士 3 3 5 2 7 5 科士 3 2 4 2 1 x 1 0 一 7 7 以土 2 7 2 2 7 8 9 3 士 4 4 5 2 7 6 5 4 土 4 1 5 2 5 x 1 0 一 8 2 6 3 1 2 6 4 2 8 0 6 5 1 3 6 5 2 7 9 5 3 1 3 2 9 2 1 0 x 1 0 一 8 2 砧土 3 2 5 2 8 2 6 5 士 又5 6 2 8 1 7 2 士 3 2 6 2 0 2 x 1 0 6 1 x 1 0 一 5 x 1 0 一 l o x 1 0 6 4 8 6 7士 7 5 1 4

32、8 6 7士 7 5 1 4 8 6 7 士 7 5 1 卯乃土 4 8 2 1 3 3 3 2 土 7 12 4 1 8 9 9 7 土 9 4 0 6 8 1 5 士 6 5 4 2 7 0 2 1 土 4 9 5 2 1 2 5 2 4 士 8 1 4 2 6 7 8 7 6 1 2 2 7 2 8 3 1 4 4 5 2 1 1 7 6 5 1 7 妊 5 6 1 9 土 5砰 7 6 6 5 土 3 6 5 2 1 1 8 肠士 1 0 3 1 2 6 2 5 4 1 7 4 5 2 7 5 7 8 1 6 盼 1 1 5 1 8 1 9 2 1 2 MK 8 0 1 注 与 对 照

33、 组 相比 O P 0 0 1 与 缺 糖缺 氧 再 灌 损 伤 组相比 2 P 0 0 1 N o t e t P 0 0 1 v s c o n t ro l 2 P 0 0 1 v s O G D R 3 2 丹皮酚对缺糖缺氧损伤引起的 C a t 升高 的抑制作用 缺糖缺氧 再灌注损伤后 细胞内 游离C a t 浓度 明显比正常组高 并随着损伤时间延长呈升高趋势 丹皮酚 及M K 8 0 1 可降低C a t 的浓度 P 0 0 1 见表2 缺糖缺氧再灌损伤导致神经细胞内游离钙 离子含量的 大量 升高 丹皮酚通过减低细胞内C a t 含量 从而达到抑制细胞内钙超载起到一定抗缺氧 作用

34、3 3 丹皮酚对N M D A受体结合力的影响 N 甲基一 天门冬氨酸受体 N M D A R 是兴奋性 氨 基酸的 特异 性受体 兴奋性氨基酸 e x c it a t o ry a m i n o a c i d s 必须通过激活突触后膜兴奋性氨基酸受体 中国药学杂志2 0 0 7 年3 月第4 2 卷第5 期 注 与 对 照组 相比 P 0 0 1 与 缺 糖缺 氧 再 灌损 伤 组 相比 2 P 0 0 1 N o te I p 0 0 l V s c o n tro l 2 P 0 0 1 v s O G D R 3 4 N O 含量和N O S 活性测定 模型组N O含量和N O

35、S活性均比正常组高且 随损伤时间延长呈上升趋势 丹皮酚及M K 8 0 1 可 显著降低各再灌时间点 N O含量和N O S 活性 P 0 0 1 见表4 5 表4 丹皮酚对N O的影响 n 8 浮土 T a b 4 E f f e c t s o f p a e o n o l o n t h e l e v e l o f N O i n O G D r e p e r f u s i o n i n j u r e d n e u ro n n 8 z 士 川 lR 怜一和叮LMH COPPP N O m m o l L 一 t C 明p C o n t m 峨 关 0 R P a e

36、L 记 一 M P a e H MK 8 0 1 m o l L 一 t 6 h 1 2 h 2 4 h 4 4 9 1 4 7 9 4 4 9 1 t 4 7 9 4 4 9 1 1 4 7 9 7 0 9 2 t 3 2 1 1 7 3 0 9 t 1 2 8 8 08 1 8 4 t 8 1 7 1 0 2 x 1 0 一 5 8 6 8 1 2 6 3 2 5 5 8 1 t 6 4 1 2 6 4 1 8 t 8 1 7 2 1 X 1 0 6 5 6 3 2 土 6 0 1 2 5 4 8 6 士 5 7 7 2 6 3 4 4 上 8 4 5 2 5 x 1 0 一 5 1 5

37、9 t 8 1 3 2 5 4 8 1 1 6 4 1 2 6 1 3 8 t 1 0 y 7 2 1 0 x 1 0 一 5 4 8 0 1 6 4 1 2 5 8 7 7 1 2 3 6 2 6 0 0 2 1 5 3 1 2 注 与 对 照 组相比 1 P 0 0 1 与 缺 糖缺 氧 再 灌损 伤 组 相比 2 P 0 0 1 N o te I p 0 0 1 cw n t io l 2 P 0 0 1 O G D R C h i n P h a r m J 2 0 0 7 M a r c h V o l 4 2 N o 5 表5 丹皮酚对N O S 的 影响 n 8 z i s T

38、a b 5 E f f e c t s o f p a e o n o l o n t h e a c t i v i t y o f N O S i n O G D r e p e r f u s i o n i n j u r e d n e u r o n n 二 8 无 土 s N O S U M L 一 t 才 一 一 G ro u p C o n t rol 0GD R mo l L一 1 2h 2 4h P a e L P a e M P a e H MK 80 1 0 2 X 1 0 6 1 x1 0一 5X1 0 6 1 0 x 1 0 6 4 1 2 0 8 5 4 1 2

39、1 0 8 5 4 1 21 0 8 5 8 0 7 1 1 4 4 9 1 9 1 0 9 7 1 1 8 7 1 3 4 1 5 2 1 土 1 1 8 2 6 9 5 1 0 5 1 2 9 璐 1 1 3 3 2 5 0 3 1 0 9 3 2 6 0 9 0 8 4 2 8 4 4 s 1 8 5 2 4 5 6 士 0 8 9 2 5 7 4 土 0 6 2 2 7 6 4 土 1 4 1 2 53 1 土 1 3 0 2 6 4 5 士 1 2 0 2 7 7 6 土 0 5 3 2 注 与 对 照 组 相比 O p 0 0 1 与 缺搪 缺 氧 再灌 损伤 组 相比 2 P 0

40、 0 1 N o te t P 0 0 1 v a c o n u o l 2 P 0 0 1 s O G D R 4 讨论 缺血性脑血管病是由于复杂的级联过程而导致 血管活性改变和神经元损伤 在损伤过程中所发生 的级联反应包括能量衰竭 钙平衡紊乱 氧化应激反 应 磷脂酶的活化 花生四烯酸的释放等 而自由基 在此过程中发挥着重要作用 1 9 5 6年 美国学者 H a r m a n 首先提出了自由基损伤的理论 认为需氧 细胞代谢过程中产生的超氧自由基具有毒害效应 可造成生物损害和衰老 以往多采用在体急性缺血损伤模型来观察细胞 形态改变和研究损伤机制 本研究通过采用大鼠神 经元原代离体培养 排

41、除活体状态下内分泌 循环 体液等多种因素的影响 研究丹皮酚是否对脑内单 个神经元有直接保护作用及其发挥作用的具体机 制 目 前研究发现 N O参与缺血性脑血管疾病的 整个病理生理过程 N O本身是一种自由基 可造 成膜脂质过氧化 还可与超氧自由基反应生成具有 强氧化作用的氧化亚硝酸离子 后者直接氧化脂质 D N A及蛋白 质琉基 锌硫中心 铁硫中心 造成细胞 致死性氧化损伤 N O参与缺血性脑血管疾病表现 为双重作用 这主要由N O S 所决定 N O S 是N O合成的关键因素 N O S 分为神经元 型N O S n N O S 内皮型N O S e N O S 和诱生型 N O S i

42、N O S 神经元型和内皮型在生理状态下即 有表达并需有钙离子参与 诱生型只在病理状态下 表达 其表达为非钙依赖性 缺血再灌早期e N O S 产生的N O可扩张血管 抑制血小板聚集和白细胞 薪附及抑制N M D A受体 表现为有益的作用 随缺 血再灌时间延长i N O S 开始表达且和n N O S 一同缓 慢而持久地大量产生 N O表现为有害的作用 Z h u 等 1s 测得i N O S 在脑缺血 再灌后i N O S 酶活 性和i N O S蛋白水平于再灌注后6h开始出现 2 4 h达到峰 值 4 8 h 开始降低 故本试验我们选择再灌6 1 2 2 4 h 这3 个时间 点来研究以

43、观察丹皮酚的 脑保护作 用 通过本实验研究发现 模型组N O量及N O S 活 性均明显比正常组高且随再灌时间的延长而逐渐增 高 用药组所测得的N O量及N O S 活性明显比模型 组低 N M D A R 是发现最早 研究最多的一种兴奋性 氨基酸受体 E A A R 其内源性配基结合位点 谷 氨酸 甘氨酸 M 扩 Z n 2 识 别位 点和 促受体激活的 多胺调制位点 近年的研究表明 N M D A R介导兴 奋氨基酸 激发钙离子细胞内流在学习与记忆 神经 发育 脑缺血等发生机制中 起着重要作用 脑 缺 血 后 神 经 末 梢 释 放 大 量 的 谷 氨 酸 司 N M D A 受体被激活

44、不仅引起一系列兴奋性氨基酸毒 性作用 又因N M D A 受体是一配体门 控型的C 扩 通 道 引起C a t 通道开放 C 扩 今 通透 性增加 大量C 扩 内流一方面因钙超载导致细胞死亡 另一方面大量 4 扩 十 与钙调素 C a M 结合 受到C 扩 C a M直接调 节的N O S 被大量激活 从而导致合成过量的N O产 生细胞毒性 本研究发现 丹皮酚可明显降低N M D A受体结合力减弱其活性 并且可显著降低细胞 内游离C 扩 减少N O 含量及减弱N O S 活性 因此 本实验认为 丹皮酚主要通过降低N M D A受体活 性 阻止C a t 内流 从而抑制钙超载及钙依赖性 N O

45、S 的激活 导致N O 生成的降 低 最终发挥抗氧化 而起到脑保护作用 i N O S 表达为非钙依赖性 在病 理状态下主要由i N O S 合成大量N O产生毒性作用 本实验结果显示 丹皮酚可显著抑制N O S 活性减少 N O 生成 故推测丹皮酚还可能通过直接抑制N O S 活性而发挥作用 此外 N M D A受体是兴奋性氨基 酸的特异性受体 也是兴奋毒性的主 要神经通路 因 此丹皮酚还可能参与抑制兴奋性氨基酸毒性作用 REF E RE NCES 1 Z H A N G L H X I A O P G H U A N G Y e t a l S t u d i e s o n p h a

46、r m a c o l o g y a n d c li n i c a l a p p li c a t i o n o f p a e o n o l J C h i n J I n te g r a t T r a d i t W e s t M e d 中西医结合杂志 1 9 9 6 1 6 3 1 8 7 1 9 0 2 R I L E Y C M R E N T C S im p l e m e th o d f o r t h e d e t e r m i n a t io n o f p a e o n o l i n h u m a n a n d r a b b i t

47、p l a s m a 场h i g h p e r f o r m a n c e li q u i d c h r o m a t o g ra p h y u s i n g s o li d p h a s e e x t ra c t io n a n d u l tr a v i o l e t d e t e c t i o n J J C h r o m a to g r 1 9 8 9 4 8 9 2 4 3 2 4 3 7 3 工 K A T S U B E N S U N A G A K A I S H I T A H e t a t O N O 1 6 0 3 a p

48、o t e n t i a l a n t i d e m e n t i a d r u g d e la y s a g e i n d u ce d a p o p t o s i s a n d s u p p r e s s e s ov e r e x p r es s i o n of g ly c e r a l d e h y d e 3 p h o s p h a t e d e h y d r o g e n i n c u l t u r e d c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m n e u r o n s J J P h

49、o r m a c o l E x p T h e r 1 9 9 9 2 8 8 1 6 1 3 4 S H K R Y L V M N I K O L A E N K O L M K O S T Y U K P G e t a t l I i g h t h re s h o l d c a lc i u m c h a n n e l a ct i v i t y i n r a t h i p p o c a m p a l n e u r o n s d u r i n g h y p o x ia J B r a i n R e 1 9 9 9 8 3 3 2 3 1 9 3 2

50、8 C h i n P h a r r n J 2 0 0 7 M a r c h V o l 4 2 N o 5中国药学杂志2 0 0 7 年3 月第4 2 卷第5 期 氟尿e Q p H依赖一 时滞型结肠定位微丸的制备及释药特性研究 李林军 黄桂华 席延卫 杨心督 顾纪锋 山 东 大 学 药 学 院 济 南2 5 0 0 1 2 摘要 目 的 制备p H依赖 一 时 滞型氛 尿喻吮 5 F U 结肠定位微丸并对其体外释药 情况及影响因 素进行研究 方法 采用 挤出 滚圆法制备空白 丸芯 将药物与溶胀材料和秘合剂混合 采用空白丸芯上药法制备载药丸芯 以乙 基纤维素为拉释层包衣材抖 E u d