丹皮酚对人大肠癌HT29细胞增殖的抑制作用_中医药学书籍_电子版书.pdf

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1、 1 2 2 丹皮酚对人大肠癌 H T 2 9细胞增殖的抑制作用 计春燕 谭诗云 刘长 武汉大学人民医院消化内科 武汉 4 3 0 0 6 0 摘 要 目的 探讨中 药丹皮酚 P a e 对人大肠癌H T 2 9细胞增殖的抑制作用及其与多种化疗药物的协同作用 方法 应用 M TT 法 邃哇蓝比 色试验 检测不同浓度的 丹皮酚和5 JKXP Q 5 F U 丝裂霉素 M M C 顺铂 D D P 对体外培养的人大肠癌H T 2 9 细胞增殖的抑制作用 同时观察低浓度的P a e 与化疗药物的协同作用 结果 P a e 可抑制H T 2 9 细胞增殖 并且与药物浓度及作用时间 呈正相关关系 低浓度

2、的P a e 与化疗药物协同可产生较强的 抑制细胞增殖作用 结论 P a e 具有直接的抗肿瘤作用 并且具有增强化 疗药物作用的功效 关健词 丹皮酚 化疗 大肠癌 中图 分类号 R 7 3 5 3 文 献标志 码 A 文 章编号 1 0 0 5 5 4 1 x 2 0 0 5 0 3 1 2 2 0 3 I n h i b i t o r y E f f e c t o f P a e o n o l o n t h e P r o l i f e r a t i o n o f H u ma n C o l o r e c t a l C a n c e r C e ll L i n e H

3、 T 2 9 a n d i t s S y n e r g e t i c E f f e c t w i t h C h e m o t h e r a p y A g e n t s J I C h u n y a n T A N S h i y u n L I U C h a n g g i n g D e p a r t m e n t o f G a s t r o e n t e r o l o g y 山e P e o p l e s H o s p i t a l Wu h a n U n i v e r s i ty Wu h a n 4 3 0 0 6 0 C h i n

4、 a A b s t r a c t O 讨 e c ti v e T o i n v e s t i g a t e t h e i n h i b i t o ry e ff e c t o f p a e o n o l o n t h e p ro l i f e r a t i o n o f h u m a n c o l o r e c t a l c a n c e r c e ll l i n e H T 2 9 a n d i t s 叮 n e r g e t i c e ff e c t c o l o r e c t a l c a n c e r w i t h c

5、 h e m o t h e r a p y a g e n t s T h e i n h i b it o ry e ff e c t o f p a e o n o l 5 F U M M C D D P w i t h d i ff e r e n t c o n c e n t r a t io n o n h u m a n c e ll l i n e i n v i rt o d e t e c t e d b y M IT a s s a y a n d t h e s y n e r g e t i c e ff e c t o f p a e o n o l i n l

6、o w c o n c e n t r a t i o n w i t h c h e m o t h e r a p y a g e n t s W 日 习 s h i p o b s e r v e d R e s u l t e s P a e o n o l c o u l d i n h i b i t t h e p ro l i f e r a t i o n o f H T 2 9 c e l l s w h i c h s h o w e d o b v i o u s c o n c e n t r a t io n e ff e c t a n d t i m e e f

7、f e c t re l a t i o n P a e i n l o w c o n c e n tr a t i o n h a d s y n e r g e t i c e ff e c t i n i n h i b i t in g t h e p ro l i f e r a t i n o f H T 2 9 c e ll s w i t h s e v e r a l c h e m o t h e r a p y a g e n t s C o n c l u s i o n P a e o n o l h a s a d i r e c t a n t ic a n c

8、 e r e ff e c t a n d c a n e n h a n c e t h e a c t i o n o f s e v e r a l c h e m o t h e r a p y a g e n t s m a r k e d l y K e y w o r d s P a e o n o l C h e m o t h e r a p y C o l o r e c t a l c a n c e r 大肠癌是临床上常见的恶性肿瘤之一 近年来其 发 病率呈上升 趋势 以5 氟脉嗡陡 5 F U 为基础 的 辅助化 疗是目 前治 疗大 肠癌最常用的 方法 2 1 但是

9、化疗副作用较大 部分患者难以耐受 此外 化疗过 程中肿瘤细胞易产生多药耐药而使大肠癌的临床化 疗失败 因此在植物中寻找有效且副作用小的抗肿 瘤药物已成为国内外重要的研究课题 研究表明 丹 皮酚 P a e o n o l P a e 具有一定的抗肿瘤活性 体外实验 发现它对多种肿瘤细胞株有增殖抑制作用 灌胃给药 有 抗小鼠 肝肿瘤作用 3 1 但P a e 对大 肠癌的 增殖抑 制作用在国内外还未见报道 本研究旨在探讨 P a e 对大肠癌H T 2 9细胞生长的影响及其与多种化疗药 物的协同作用 1 材料和方法 1 1 材料人大肠癌细胞株 H T 2 9 购自中南大学肿 瘤研究所 主要药物和

10、试剂 P a e购自 上海第一制药 基金课题 湖北省自 然科学基金资助课题 编号 2 0 0 4 A B A 2 4 3 通信作者 厂 1 0 m g 2 m l 批号 9 9 0 4 0 2 临用前用 R P M I 1 6 4 0 培养 液 稀释 成 终浓度为3 9 1 一 2 5 0 m 酬 L o 5 F U 为 上 海旭东海普药业有限公司产品 M M C 为T o k y 公司 产品 D D P 为山东齐鲁制药厂产品 R P M I 1 6 4 0培 养基为美国G I B C O公司产品 小牛血清为杭州四季 青生 物 材料 研究 所提 供 四 唾哇蓝 M T T 美国S i g m

11、a 公司产品 用 p H为7 4的P B S 溶解 5 g L 过 滤除菌 置棕色小瓶中4 冰箱保存 二甲基亚矾 D M S O S i g m a 公司产品 1 2 仪器与设备 C O 培养箱为美国H A R I S 公司产 品 酶标仪为美国B I O T E K公司产品 医用超净工 作台为北京半导体设备一厂产品 1 3 方法 1 3 1 细胞培养将 H T 2 9 细胞培养在含 1 0 小 牛血清的R P M I 1 6 4 0 培养液中 加人青霉素1 0 0 u L 链霉素1 0 0 m g L 置3 7 t 5 C O 培养箱内培养 每 3 一 4d 用0 2 5 胰酶消化传代1 次

12、取对数生长期 细胞用于实验 1 3 2 P a e 对 H T 2 9细胞生长的影响M T T法参照 文献 4 3 取对数生长期的H T 2 9 细胞以5 x 1 0 4 m l 每 孔0 2 m l 接种于 孔培养板 2 4 h 细胞贴壁生长后 1 2 3 分为实验组和对照组 实验组分别加人不同浓度的单药抑制实验的结果 P a e 设7 8 1 m g L 根据预实 P a e 浓度分别为3 9 1 m g L 7 8 1 m g L 1 5 6 3 m g L 验测得的药物 1 C 3 0 抑制浓度 值 5 F U用 1 0 3 1 2 5 m g L 6 2 5 m 群L 1 2 5 m

13、 g L 2 5 0 m g L 每组m g L M M C 用0 5 m g L D D P 用1 0 m 岁L 取对数生 设5 个复孔 对照组加人等量培养液 连续培养2 4 长期的H T 2 9 细胞以5 x 1 0 4 m l 每孔0 2 m l 接种于 4 8 7 2 9 6 h 根据细胞生长情况 每天换液1 次 分别 孔培养板中 待细胞贴壁后分组 单药组分别加人 于2 4 4 8 7 2 及 h 每次实验结束前4 h 每孔加人2 0上述浓度的P a e 和各种化疗药 联合用药组同时加 闪 M TT 液显色 继续培养4 h 弃上清液 然后每孔加人上述浓度的P a e 和化疗药 每组设5

14、 个复孔 对照 2 0 0 闪 D M S O 振荡1 0 m i n 用酶标仪测定5 7 0 n m处组加人等量培养液 作用4 8 h 后 用M TT 显色 测定 各孔的吸光度值 药物对细胞增殖抑制率的计算方5 7 0 m n的吸光度值 计算各组细胞的生长抑制率 法为 抑制率 二 1 一 实验组平均A值 对照组平均A 1 4 统计学处理 S P S S 1 0 0软件统计方差分析 值 x 1 0 0 1 3 3 细胞形态的观察取对数生长期 H T 2 9细胞2 结果 消化传代并延续培养2 4 h 后换含不同浓度 P a e 的培 养液培养 倒置显微镜下观察细胞生长情况 H E染2 1 P a

15、 e对 H T 2 9细胞增殖的抑制作用P a e在 色标本的制备 将细胞涂片用冷丙酮 4 固定 2 0 7 8 1 2 5 0 m 盯L浓度范围内对 H T 2 9 细胞的增殖均 m i n 自 然凉干 水化后用0 5 T ri t o n x 1 0 0 P B S 处理有抑制作用 药物浓度越高 作用时间越长 其抑制作 1 0 m i n 水化后G i ll 苏木精染2 m i n l 盐酸乙醇i s 用越强 呈现明 显的 剂量依赖效应关系和时间依赖效 4 2 9 0温水蓝化1 0 m in 伊红染2s 常规脱水封片 应关系 见表1 1 3 4 P a e 与4种化疗药物的协同作用根据以上

16、 表1 丹皮酚对大肠癌细胞增殖的影晌标土 n 二 6 P a g m 盯L A值抑制率 A值抑制率 A值抑制率 A值抑制率 0 2 8一 0 2 4 4 8 8 9 1 0 7 3 t 0 0 2 11 3 3 8 t 0 0 2 41 5 9 5士0 0 1 9 1 0 1 4士0 0 3 1 2 9 8 21 3 4 1 0 0 3 3 673840749571529849 356879858991 0 3 0二 0 2 3二 0 1 6 0 2 5二 0 8 7 1 10 0 1 3 1 8 0 5 7 5土0 0 2 6 4 6 0 4 2 3士 0 0 8 1 二6 0 3 3 8

17、6 2 1 9 0 2 5 8 9 3 4 7 2 1 9 0 1 4 5 7 1 0 0 2 4 8 6 5 2 1 0 2 6 1 0 0 1 4 0 4 9 7 1 0 0 3 1 二 826412578456州 91816325 0371531 OQU 77 6 2 5 0 1 2 5 以 0 3 1 7 10 0 1 4 7 8 0 2 5 8 5 5 1 8 0 3 2 3 0 0 1 8二 0 2 7 8 1 0 0 2 4 0 2 2 7士0 0 2 5二 1 0 8 4 1 0 0 2 5 0 5 7 0土0 0 1 7二 0 3 8 6 10 0 3 0二 0 3 0 5士

18、0 0 2 3 0 2 0 1 1 0 0 1 4二 0 0 0 0 0 0 土土士土士土 859817751599439329 0 0 0 0 0 0 0 1 6 7士0 0 1 6二 2 5 0 0 0 0 2 5 2土 0 0 1 4二 0 2 2 5 10 0 2 5 0 2 0 2 t 0 0 1 6 8 1 1 7 40 1 7 1 1 0 6 1 9 二8 7 6 8 0 0 1 3 0 t 0 0 2 5二 573325803622676概 123048617073 注 v s 对照组 P 0 0 5 P 0 0 1 P a e 浓度为0 m g L P 0 0 1 v s 对

19、照组 P a e 0 m g L 2 2 细胞形态的观察结果倒置显微镜下每日 观察 各组细胞的形态变化 对照组细胞生长良 好 呈高折 光率 胞体大 呈圆形 随时间延长变化不大 P a e 组 细胞随着药物浓度增大和时间延长 细胞逐渐变小 折光率减弱 但细 胞膜完整 最后裂 解 2 5 0 m g L P a e 组除见少数圆形细胞外 可见大量悬浮的细胞碎片 H E染色可见对照组正常细胞核均匀着色呈现淡蓝色 或蓝色 未见凋亡小体 3 1 2 5 m 留 L 一 2 5 0 m 酬L 浓度 范围P a e 组出现较多的凋亡细胞 表现为细胞体积缩 小 核固缩 碎裂 深染 部分裂解形成凋亡小体 另 可

20、见肿胀的坏死细胞 细胞膜的连续性破坏 核染成 很淡的蓝色甚至蓝色消失 2 3 P a e 协同 化疗药物对H T 2 9 细胞增殖的抑制作 用P a e选择浓度为 7 8 1 m g L 其抑制率为 1 8 8 2 6 化疗药物选择 I C 值作为协同作用实验 的浓度 P a e 与化疗药物同时作用于H T 2 9细胞 对 其生长的抑制有显著的协同 作用 见表2 0 1 2 4 表2 P a e 协同3 种化疗药物对H T 2 9 细 的协同抑制作用 x t s n 6 分组 对照组 单药组 P a e 5 一 F U MMC DDP 联合用药 P a e 5 F U P a e MMC P

21、a e DDP A值抑制率 1 0 7 3 t 0 0 2 1 0 8 7 1 t 0 0 1 3 0 7 5 1 1 0 0 2 8 0 7 4 9 1 0 0 3 0 0 7 4 5士 0 0 1 9 1 8 8 2 6二 3 0 0 0 2二 3 0 1 5 1 二 3 0 5 6 9二 0 2 8 0 10 0 3 7 3士 0 0 4 9 7土 0 0 0 9 7 3 8 8 4 0 0 2 5 6 5 2 6 7 0 0 1 8 5 3 7 3 1 吧 注 表中P a e 5 F U M M C D D P 的浓度分别为7 8 1 m 岁L l o m 岁L 0 5 m g L 1

22、 0 m g L 与 对照 组比 较 二P 0 0 1 与单药组比 较 0 P 0 0 1 3 讨论 及D D P 协同应用可产生较强的抑制细胞增殖作用 抑 制率分别达到7 3 8 8 4 6 5 2 6 7 和5 3 7 1 3 与单 药组抑制率的比较其差异具有显著统计学意义 尸 0 0 1 其中以P a e和5 F U联用的协同作用最为显 著 目 前临床所用的化疗药物均有一定的抗肿瘤作 用 但由于其毒副作用而限制了其长期使用 加之肿 瘤易产生多药耐药性 使得化疗的效果不尽如人意 中药丹皮酚具有抗肿瘤作用 同时能提高机体免疫 力 且无明显副作用 如能在临床中用于抗大肠癌治 疗或在化疗中与5

23、F U等化疗药物联合应用 必将能 提高化疗药物的抗肿瘤作用 同时也能因化疗药物的 剂量减少而降低常规化疗药物的毒副作用 本研究 为丹皮酚的临床应用提供了实验依据 为大肠癌的中 药防治开辟了一条新途径 参考文献 谢正勇 卿三华 结直肠癌发病率及解剖部位变化趋势 J 世 界华人消化杂志 2 0 0 3 1 1 7 1 0 5 0 T e b b u tt N C C a tt e l l E M i d g l e y m R e t a l S y s t e m i c t r e a t m e n t o f c o l o r e t a l c a n c e r J E u ro p

24、 e a n J o u r n a l o f C a n c e r 2 0 0 2 3 8 1 0 0 0 孙国平 沈玉先 张玲玲 等 丹皮酚对H e p A荷瘤小鼠免疫调 节和抑瘤作用研究 J 中国药理学通报 2 0 0 3 1 9 2 1 6 0 S a r g e n t J M T a y l o r C G A p p r a i s a l o f t h e M T T a s s a y a s r a p i d t e s t o f c h e m o s e n s t iv i t y i n a c u te m y e l o id l e u k e m

25、i a J B r J C a n c e r 1 9 8 9 6 0 2 2 0 6 R il e y C M R e n T C S i m p l e m e t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n o f p a e o n o l i n h u m a n a n d r a b b it p l a s m a 勿h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p 衍u s i n g s o l i d p h a s e e x t r a c t i o

26、n a n e u l t r a v i o l e t d e t e c t i o n J J C h ro m a t o g r 1 9 8 9 4 8 9 2 4 3 2 C h a n g H L H u n g C F Y e h C C e t a l P a e o n o l p ro m o t e d 2 a m i n o fl u 月 J J 且2 ILF L J气esJ 内j4 r LLI几J 丹皮酚是毛蓑科植物牡丹 P a e o n i a S u f fr u i c o s a A n d r 根皮和萝摩科植物徐长卿P y c n o s t e l

27、m a P a n i c u la t u m B u n g e K S c h u m干燥根或全草的主要有效成 分 5 0 P a e 是 一 种 小 分 子 的 酚 类 化 合 物 呈白 色 针 状 结晶 其相 对 分 子 量为1 6 6 1 8 k D 分 子 式为C g H to 0 3 9 化学结构是 2 经基4 一 甲氧基苯乙酮 研究结果表明 P a e 具有镇静催眠 解热镇痛 抗菌消炎 免疫调节 抗 氧 化 及 保护 心 脑血管等广泛的 药理活 性 6 一 9 此外 P a e 能促进 S D大鼠白细胞中致癌物质 2 氨基药的乙 酞 化 6 1 能 提高 人结 肠肿瘤细 胞中

28、N 一 乙 酞 转移酶 N a c e ty l tr a n s f e r a s e N A T 的 活 性 且 呈剂 量 依赖 性 to 说 明P a e 具有一定的抗肿瘤活性 本实验研究发现 P a e 在7 8 1 2 5 0 m g L的6 个浓度下 对H T 一 细胞 株的增殖均有抑制作用 随着药物浓度的升高和作用 时间的延长 抑制细胞增殖的作用逐步增强 呈现明 显的浓度效应及时间效应关系 本实验中P a e 作用 于大肠癌H T 2 9细胞 通过光镜H E染色可观察到凋 亡的肿瘤细胞 推测P a e 作用于大肠癌 H T 2 9细胞 的 作用机理可能与诱导大肠癌 H T 2

29、9细胞凋亡有关 有关 P a e 抑制肿瘤细胞增殖的机制笔者正在继续研 究之中 P a e 除了自 身具有直接抑制肿瘤细胞增殖的 作用外 还能对多种化疗药物有增敏作用 低浓度的 P a e 7 8 1 m g L 单独应用对H T 2 9细胞的抑制率仅 为1 8 8 2 6 而其与I C 浓度的化疗药物5 F U M M C o r e n c e a n d p a m i o b e n z o i c a c i d a c e t y l a t io n s b y m o n o n u c l e a r h e u c o c y t e s f r o m s p r a g

30、 u e d a w l e y r a t s J C y t o b i o s 2 0 0 0 1 0 3 4 0 4 1 4 9 7 丘少鹏 王道虎 刘卓炜 等 丹皮酚磺酸钠在动物肾 缺血再灌注 损伤中的作用 J 中 华肾脏病杂志 2 0 0 1 1 7 3 1 8 5 8 丁卫祥 包仁尧 邵国富 等 丹皮酚 尼莫通对大鼠 脑出血后r C B F 脑水分含量及神经行为学干预作用的研究 J 中国血液流 变学杂志 2 0 0 1 1 1 1 2 1 9 戴敏 刘青云 顾承刚 等 丹皮酚对脂质过氧化反应及低密度脂 蛋白 氧化修饰的抑制作用 J 中国中药杂志 2 0 0 0 2 5 1 0 6 2 5 1 0 C h u n g J C P a e o n o l p r o m o t i o n o f D N A a d d u c t f o r m a t io n a n d州 a m i n e s N a c e t y l t r a n s f e r a s e a c t iv i ty i n h u m a n c o l o n t u m o u r c e ll s J F o o d C h e m T o xi c o l 1 9 9 3 3 7 4 3 2 7 收稿日 期 2 0 0 4 1 1 1 0